Rekombinant DNK olish

Mavzular

Genetik rekombinatsiya

Genetik rekombinatsiya – bu turli manbalardan olingan genlarning yoki genlarning normal biologik almashinuvi natijasida o‘zgargan xromosomaning hosil bo‘lishi. Yangi DNK molekulasi DNK zanjirining uzilishi yoki birikishi yo‘li bilan rekombinatsiya jarayonida hosil bo‘ladi. Irsiy axborotning o‘tkazilishi, almashinishi va o‘zgarishining tabiatda turli shakllari bo‘lib, ular yangi xususiyatlarga ega bo‘lgan organizmlarning paydo bo‘lishi uchun manba sanaladi.

Turli organizmlarning genlarini sun’iy yo‘l bilan birlashtirib, rekombinant DNK olish mumkin. Gen muhandisligi yoki rekombinant DNK texnologiyasida tajribalar yo‘li bilan bir organizm (donor) irsiy materialini boshqa organizm (retsipiyent)ga o‘tkazish orqali bu genlarning irsiylanishi ta’minlanadi.

Rekombinant DNKning qo‘llanilishi

Masalan, mikrobiologiya sanoatida azot fiksatsiyalovchi genlar kiritish yo‘li bilan o‘simliklar hosildorligini oshirishda qo‘llaniladigan bakteriya shtammlari olinadi (bu o‘g‘itlarning ishlatilishini kamaytiradi va atrof-muhit holatini yaxshilaydi). Hozirgi kunda gen muhandisligi metodlari rekombinant bakteriya shtammlaridan biologik faol birikmalar, jumladan, gormonlar (insulin, o‘sish gormoni, somatostatin), virusga qarshi preparat – interferon olishda muvaffaqiyatli qo‘llanilmoqda. Genlarning boshqa organizm genomiga to‘g‘ridan to‘g‘ri ko‘chirib o‘tkazilishi irsiy nuqsonlarni to‘g‘rilashga imkon beradi. Rekombinant DNK olish yo‘li bilan irsiy kasalliklarni davolash istiqbolli bo‘lib, bunda bemor genomiga zararlangan gen o‘rniga normal funksional gen kiritiladi.

Boyer va Koen: kesish

Sun’iy ravishda rekombinant DNK olish va genlarni klonlash ilk bor 1972-yilda AQSH olimlari Boyer va Koen tomonidan amalga oshirildi. Bu olimlar E.coli bakteriyasining xromosoma DNKsi va shu bakteriya plazmidasiga alohida probirkalarda «yopishqoq» uch hosil qiluvchi EcoRI (eko-er-bir) restriktaza fermenti bilan ishlov berganlar. Halqasimon plazmid tarkibida faqat bir dona EcoRI restriktaza fermenti tanlab kesadigan maxsus nukleotidlar izchilligi bo‘lganligi sababli restriktaza DNK qo‘sh zanjirini faqat bir joydan kesib halqasimon plazmidni yopishqoq uchli ochiq holatga o‘tkazadi. Xromosoma DNK molekulasida EcoRI restriktaza fermenti taniy oladigan maxsus nukleotidlar izchilligi qancha bo‘lsa, bu molekula shuncha bo‘lakka bo‘linadi.

Ajratish va ulash

DNK bo‘laklarini elektroforez moslamasida kuchli elektr maydonida katta-kichikligiga qarab ajratiladi va hosil bo‘lgan bo‘laklar maxsus bo‘yoq bilan bo‘yaladi. Elektroforez gelidan kerakli DNK bo‘lagini suvda eritib ajratib olish mumkin. Boyer va Koen shu usullar bilan ajratib olingan yopishqoq uchli xromosoma DNK bo‘lagini ochiq holatdagi yopishqoq uchli plazmid DNKsi bilan probirkada aralashtirib ligaza (ulovchi) fermenti vositasida bu ikki xil DNK bo‘laklari uchlarini bir-biriga kovalent bog‘lar yordamida uladilar. Natijada plazmid tarkibiga xromosoma DNK bo‘lagi kiritildi. Shu usulda ilk bor rekombinant plazmid hosil qilindi. Bu molekular qurilmada (konstruksiyada) plazmid DNK vektor (yo‘naltiruvchi) funksiyasini bajaradi, chunki yuqorida aytib o‘tganimizdek plazmidlar DNKsiga rekombinatsiyalana oladi.

Antibiotik bilan tanlash

Bu vektor konstruksiya o‘z tarkibida antibiotikka chidamlilik geni bo‘lganligi uchun maxsus yaratilgan plazmidsiz, ya’ni antibiotikka chidamsiz shtamm hujayralariga kiritildi. Rekombinant plazmid kiritilgan bakteriya hujayralari kloni antibiotikka chidamli genga ega bo‘lib qolganligi sababli, plazmidsiz bakteriyadan farq qilib, antibiotik ta’sirida nobud bo‘lmaydi. Shu sababli tajriba o‘tkazayotgan probirkaga antibiotik qo‘shib rekombinant bakteriya kloni ajratib olinadi va klonlanadi. Bu klonni tashkil etuvchi har bir bakteriyada yot (geterologik) DNK bo‘lagi bor bo‘lib, bakteriya biomassasi qanchalik ko‘paytirilsa, yot DNK bo‘lagi shunchalik ko‘payishi mumkin. Undan tashqari, rekombinant plazmid vektor avtonom replikatsiyalanuvchi plazmid bo‘lsa, yot DNK bo‘lagini yana o‘nlab barobar ko‘paytirish mumkin (70-rasm).

Genlarni klonlash va dastlabki bosqichlar

Yot DNK bo‘lagini rekombinant vektor konstruksiyalar vositasida ko‘paytirish genlarni klonlash deb ataladi. DNK bo‘lagini klonlashda vektor sifatida virus va fag DNK molekulasidan yoki ko‘chib yuruvchi genetik elementlardan ham foydalanish mumkin.

Demak, gen muhandisligida quyidagilar amalga oshiriladi:

• 1. Kerakli genga ega donor organizmlardan zarur genlar ketma-ketligiga ega bo‘lgan DNK molekulasi ajratib olinadi.
• 2. Donor DNKsining zarur geni fermentlar ta’sirida boshqa qismlardan ajratib olinadi.
• 3. Retsipiyent hujayra (qabul qiladigan hujayra)ga biror genni kiritish uchun mazkur hujayraga kira oladigan uncha katta bo‘lmagan DNK molekulasidan foydalaniladi. Bunday molekula vektor deyiladi.

Rekombinant DNK ketma-ketligi

• 4. DNK-vektorni donor genini kiritish mumkin bo‘lgan joyidan ferment yordamida kesiladi.
• 5. Ajratib olingan gen vektor molekulaga «tikiladi». Rekombinant DNK hosil qilinadi va klonlanadi. Kiritilgan gen saqlovchi yangi DNK molekulasi xo‘jayin retsipiyent hujayrasiga kiritiladi.
• 6. Xo‘jayin hujayrada DNK replikatsiyalanadi va hujayraning bo‘linishi orqali avlodlarga beriladi.
• 7. Rekombinant DNKni xo‘jayin hujayraga kiritish transformatsiya deyiladi. Yot DNK bo‘lagiga ega bo‘lgan organizmlar transgen organizmlar hisoblanadi.

Bilimingizni sinang